1543 wird das Gebiet des heutigen Paraguay dem spanischen Vizekönigreich Perú angegliedert. Gouverneur der Kolonie wird Domingo Martínez de Irala, der die Verschmelzung zwischen spanischen Einwanderern und den Guaraní fördert. Er selbst geht mit "gutem Beispiel" voran, nimmt sich 70 Guaraní-Frauen, mit denen er unzählige Kinder in die Welt setzt. Die aus diesen Verbindungen hervorgehenden Mestizen zählen sich selbst zur weißen Oberschicht und unterdrücken die Guaraní zunehmend.
1604 wird die erste von später rund 30 "Jesuitenreduktionen" gegründet. Dies sind Dorfgemeinschaften für bis zu 10.000 Guaraní, zu denen Mestizen und weiße Siedler keinen Zugang haben. Offiziell untersteht dieser "Jesuitenstaat" zwar der spanischen Oberherrschaft, besitzt jedoch eine eigene Verwaltung und ist nach außen hermetisch abgeriegelt. Die Guaranì sind ein fleißiges Bauernvolk, das das Land kennt, und so produzieren sie bald große landwirtschaftliche Überschüsse. Dieser Erfolg ist den spanischen Kolonialherren ein Dorn im Auge, die deshalb nichts gegen Übergriffe von Sklavenjägern unternehmen. Die Konflikte zwischen Jesuiten und Kolonisten spitzen sich immer mehr zu, bis 1767 die Reduktionen geschlossen und die Jesuiten auf Befehl des spanischen Königs aus Mittel- und Südamerika vetrieben werden.
1776 wird Paraguay dem neu gegründeten spanischen Vizekönigreich des Río de la Plata mit dem heutigen Argentinien und Bolivien angegliedert.
